Das Spiel beginnt mit dem Auftreten der Hauptperson namens Link, die sich in einem kleinen Dorf namens Ordon als Ziegenhirte verdingt. Neben dem Zusammentreiben der Ziegen und kleineren Hilfsdiensten genießt Link die Ruhe und Abgeschiedenheit des kleinen Örtchens, als sein Freund, der Schwertkämpfer Moe, ihn beauftragt, ein von Moe geschmiedetes Schwert an den Königshof nach Schloss Hyrule zu bringen.

Noch bevor Link diesen Auftrag ausführen kann, wird er von Monstern niedergeschlagen, die sowohl die Tochter des Bürgermeisters als auch die anderen Kinder aus dem Dorf entführen. Nachdem Link wieder zu sich gekommen ist, versucht er, die Spur der Übeltäter aufzunehmen und steht schließlich vor einer riesigen, fluoreszierenden Wand – dem Eingang zum Schattenreich. Viel Zeit zum Staunen bleibt ihm aber nicht, denn er wird blitzartig in das Schattenreich hineingezogen. Kaum dort angekommen, macht Link auch schon eine merkwürdige Metamorphose durch und nimmt die Gestalt eines Wolfes an. Unser Held wird gefangen genommen und nach Schloss Hyrule gebracht. Im dortigen Verlies trifft er auf eine ungewöhnliche, schwebende Kreatur namens Midna, mit deren Hilfe es ihm gelingt, aus dem Verlies zu entkommen.

Anschließend begegnen Link und Midna Prinzessin Zelda, die berichtet, wie es zu der seltsamen Verwandlung von Hyrule kam. Der selbsternannte König der Schattenwelt Zanto stellte sie vor die Wahl zu kapitulieren und Hyrule den Schatten zu übergeben oder alle Bewohner Zantos Wut und somit dem sicheren Tod preiszugeben. Zelda kapitulierte und Hyrule fiel in die Schatten, in denen die Menschen nur als geisterhafte Wesen existieren. Von Schuldgefühlen zerfressen versteckt sich Zelda in einem Turm und schickte Midna aus, um etwas zu unternehmen. Diese fand Link, der sich in den Schatten nicht in einen Geist, sondern „nur“ in einen Wolf verwandelt und erkannte ihn als Auserwählten, dem die Macht innewohnte Hyrule zu retten (und Midnas eigenen Wünschen zu entsprechen). Midna und Link fliehen aus dem Schloss Hyrule. Die Schattenwelt hat sich mittlerweile fast bis zum Dorf Ordon ausgedehnt. An einer Quelle nahe dem Dorf trifft Link auf den Lichtgeist Latoan, der ihm von den anderen Lichtgeistern berichtet, die über Hyrule wachen. Latoan berichtet, dass Zanto ihnen das Licht nahm um ihre Gebiete in den Schatten zu stürzen. Links erste „richtige“ Aufgabe ist es nun, die anderen drei Lichtgeister (Phirone, Eldin und Ranelle) wieder auf die Bildfläche zu verhelfen. In den jeweiligen Regionen müssen zuerst Schattenkäfer gefunden und ausgeschaltet werden, um ein magisches Artefakt namens „Tiegel des Lichts“ zu füllen. Im Anschluss daran wartet ein Dungeon darauf, erkundet zu werden. Midna, die Link dabei begleitet, ist derweil auf der Suche nach einer Waffe, mit der sie Zanto vernichten und ihr Schattenreich retten kann.

Selbstverständlich befreit Link die Lichtgeister und schlägt sich auch durch die Dungeons, außerdem findet er die entführten Kinder von Ordon in dem Dorf Kakariko in sicherer Obhut eines Priesters so dass schließlich alle Schattenkristalle, die man in den Dungeons erbeuten konnte, in Midnas Händen liegen. Doch kaum erscheinen die beiden wieder an der Quelle von Ranelle, erscheint Zanto und verbannt den Lichtgeist zurück in die Schatten. Link wird somit wieder zum Wolf und bekommt einen Nachtkristall in den Kopf eingepflanzt. Danach erweckt Zanto den Lichtgeist Ranelle wieder zum Leben und dieser stürzt sich auf Midna welche die geballte Macht des Lichts zu spüren bekommt. Zanto verschwindet wieder und Midna ist so stark geschwächt, dass sie dem Tod nahe ist. Link macht sich abermals auf den Weg nach Schloss Hyrule, um Prinzessin Zelda aufzusuchen. Diese opfert ihre ganze Kraft und überträgt sie auf Midna. Als letzten Tipp gibt sie Midna und Link noch den Hinweis mit auf den Weg, dass der einzige Weg zu Links alter Gestalt das sagenhafte Masterschwert sei.

Link findet das Schwert schließlich nach diversen Rätseln, Irrungen und Wirrungen im Heiligen Hain, einem uralten Waldstück. Midna schenkt Link endlich reinen Wein ein und erläutert, dass der einzige Weg, Hyrule zu retten und Zanto aufzuhalten, über den so genanntenSchattenspiegel führt – ein uraltes Artefakt, das die Götter von Hyrule einst als einzige Verbindung zwischen dem Schattenreich und Hyrule hinterlassen hatten. Link erfährt, dass sich dieser Spiegel in der Gerudo-Wüste befindet und macht sich auf in die Wüstenburg. Als Midna und Link endlich in der Spiegelkammer ankommen, müssen sie leider feststellen, dass Zanto den Spiegel schon in vier Scherben zerbrochen hat. Seine Absicht war, den Spiegel zu zerstören, wozu allerdings nur der wahre Herrscher des Schattenreichs in der Lage ist. Eine der vier Scherben befindet sich noch an Ort und Stelle, aber von den drei anderen fehlt jede Spur. Es folgt noch der Hinweis, dass Zantos Macht wohl vom „Prinzen der Diebe“, Ganondorf, abstammen soll.

Nach langen Reisen und einigen Dungeons finden Link und Midna schließlich sowohl die Spiegelfragmente als auch den Weg ins Schattenreich. Am Ende der Reise wartet Zanto, über den man erfährt, dass er eigentlich König geworden wäre, aber in der Thronfolge übergangen wurde, weil seine Augen angeblich eine ungeheure Machtgier widerspiegelten. Außerdem wird das Geheimnis um Midna gelüftet – sie ist die Prinzessin der Dämmerung (Twilight Princess), die von Zanto in ihre gegenwärtige Gestalt gebracht wurde, und somit eigentlich die wahre Herrscherin über das Schattenreich. Letztlich muss sich auch Zanto den präzisen Schwerthieben unseres Helden geschlagen geben, und tritt seine letzte Reise nach Hyrule an.

Mittlerweile stellt sich heraus, dass Ganondorf von Anfang an hinter der ganzen Geschichte steckte. Er war es auch, der das Schloss von Hyrule mit einer magischen Barriere umgab. Mit Hilfe von Midna, die sich dank der Schattenkristalle in ein riesiges schleimiges Wesen verwandelt, kann die Barriere durchdrungen werden, wodurch es für sie und Link möglich ist, ins Schloss vorzudringen. Nachdem sie endlich den Thronsaal erreicht haben, folgt der Kampf gegen Ganondorf. Mit vereinten Kräften von Link, Zelda, Midna und Links treuem Pferd Epona wird Ganondorf schließlich besiegt.

Die Lichtgeister entschließen sich, Midna ihre alte Gestalt zurück zu geben. Nach einem bewegenden Abschied verlässt sie die Lichtwelt von Hyrule und zerstört die Verbindung zwischen den beiden Welten mit einer Träne. Link und Epona kehren nach Ordon zurück. Während der Abspann läuft, sieht man Link mit Epona aus Ordon reiten um neue Abenteuer zu suchen.